海洋抗腫瘤藥物研究

海洋是生命的起源地。占地球表面積的70、體積的90%以上，不但蘊(yùn)藏著大量豐富的礦產(chǎn)和能源，也包含著地球上80%以上的生物資源。由于壓力、鹽分、溫度和地質(zhì)形態(tài)的相對變化，海洋中的生物種群復(fù)雜多樣、種類繁多;他們通過食物鏈、化學(xué)信息、化學(xué)進(jìn)攻和防御機(jī)制相互依存、相互獨(dú)立，維系著獨(dú)特、緊密的海洋生物生態(tài)體系。為了生存，海洋生物代謝產(chǎn)生許多具有特殊作用的生理活性物質(zhì)，是人類與疾病斗爭可利用的重要物質(zhì)資源。有人講下一世紀(jì)是海洋藥物的世紀(jì)，不論這種說法是否準(zhǔn)確，但可以肯定人們研究較少的巨大海洋生物資源在下世紀(jì)將是人們普遍重視的藥物資源。1.海洋生物提取物抗腫瘤活性初步篩選海洋抗腫瘤藥物研究是有針對性地從海洋生物中尋找抗腫瘤物質(zhì)，開發(fā)抗腫瘤藥物?？鼓[瘤活性是重要的研究指標(biāo)，只有提取物顯示一定的抗腫瘤活性，才有進(jìn)一步研究的意義;所以提取物的初步研究抗腫瘤活性篩選是指用靈敏、快速、可靠的抗腫瘤活性測試方法從大量海洋生物提取物中篩選出有抗腫瘤活性的提取物，以進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。為了達(dá)到以上目的就需要建立靈敏、快速、可靠的活性測試篩選方法。隨著人們對腫瘤研究的不斷深入和認(rèn)識(shí)，各種靈敏、快速的抗腫瘤活性測試活性測試方法在不斷建立、完善和發(fā)展。目前，抗腫瘤藥物研究中用于初期活性測試篩選的方法有兩類，一類是腫瘤細(xì)胞毒水平的篩選，另一類是機(jī)理水平的篩選。腫瘤細(xì)胞毒素的篩選是利用體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞來觀察待測物質(zhì)對培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷或生長抑制等現(xiàn)象的篩選方法。該方法的主要特點(diǎn)是操作簡單、經(jīng)濟(jì)，在許多試驗(yàn)室都可進(jìn)行;但腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)中受多種因素的影響，并且許多腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)需要體外需要特殊條件。機(jī)理水平的篩選是利用已發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的生物酶、受體和基因?yàn)榘悬c(diǎn)，觀察待測物質(zhì)對它們的抑制、激活、分解等現(xiàn)象的篩選方法;其主要特點(diǎn)是非常靈敏;可檢出微量活性成份，但酶、受體或基因等生物材料較難得到，并且價(jià)格昂貴。機(jī)理水平的篩選是細(xì)胞外實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞外有活性的化合物，在細(xì)胞內(nèi)不一定有效。所以機(jī)理水平篩選出的活性化合物在開發(fā)為抗腫瘤藥物的過程中還需經(jīng)過腫瘤細(xì)胞毒水平篩選的驗(yàn)證。在從天然資源尋找抗腫瘤活性化合物的過程中，從大量生物材料中提取得到巨大數(shù)量的提取物和分離組分;如果每個(gè)提取物和分離部分都用人工操作篩選，已不能滿足研究的需要。近年來研究開發(fā)完全由計(jì)算機(jī)控制的機(jī)械操作高通量篩選裝置已問世，并在國內(nèi)外推廣應(yīng)用，該方法一次操作可確定完成幾百至數(shù)百千個(gè)樣品篩選。高通量篩選方法的應(yīng)用也將極大地加快海洋生物抗腫瘤藥物研究步伐。2.抗腫瘤藥物試劑從海洋生物中篩選得到的抗腫瘤活性化合物在開發(fā)為抗腫瘤藥物前，首先要對其劑量、劑型等構(gòu)成進(jìn)行研究設(shè)計(jì)。劑量過大會(huì)引起許多毒、副作用，劑量太小則療效不明顯;劑型不好、用藥途徑不當(dāng)，生物利用度不高，也會(huì)降低療效?？鼓[瘤藥物構(gòu)成設(shè)計(jì)是在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行。按不同劑量和不同劑型設(shè)計(jì)抗腫瘤藥物，給動(dòng)物用藥，觀察不同用藥情況下動(dòng)物各組織、器官病理和生理變化，研究劑量、劑型、毒性和療效間的關(guān)系，從而確定活性化合物作為抗腫瘤藥物的適量劑量和劑型，為人體試驗(yàn)提供依據(jù)。3.抗腫瘤藥物動(dòng)物完全試驗(yàn)良好的抗腫瘤藥物不但要有良好的治療效果，而且要安全。動(dòng)物安全實(shí)驗(yàn)是保證研究開發(fā)的抗腫瘤藥物有效安全的重要步驟。其方法是在不同動(dòng)物小鼠、兔子、狗和猴子等身上試用，觀察抗腫瘤藥物的毒性情況，評價(jià)藥物的安全性。主要包括急性毒性試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)。急性毒性實(shí)驗(yàn)是以較大劑量給動(dòng)物用藥，觀察動(dòng)物對藥物的毒性反應(yīng)和用藥后動(dòng)物各組織、器官生理和病理變化。慢性毒性試驗(yàn)是以一定有效劑量，長期給動(dòng)物用藥，觀察藥物的致畸、致癌、致突變等不良性質(zhì)以及長期用藥后動(dòng)物各組織、器官病理和生理變化，只有在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中低毒、安全的藥物才可進(jìn)行下一步人體試驗(yàn)。4.I期臨床試驗(yàn)我們知道實(shí)驗(yàn)動(dòng)物余人有著明顯的種系差異，對動(dòng)物安全有效的藥物對人體不一定安全有效。所以通過動(dòng)物篩選出的抗腫瘤藥物還經(jīng)過人體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。I期臨床試驗(yàn)是抗腫瘤藥物進(jìn)行人體試驗(yàn)的初級階段，主要研究藥物對人體的毒性情況，觀察抗腫瘤藥物在不同劑量下對人體不同組織、器官的病理和生理影響及劑量―毒性―療效之間的關(guān)系，確定人體對腫瘤藥物的最大耐受劑量和最佳治療劑量，確?？鼓[瘤藥物在人體用藥時(shí)安全有效。國際上通常要求I期臨床在1-2個(gè)癌癥治療中心進(jìn)行，然后進(jìn)行綜合分析評價(jià)。試驗(yàn)對象是安全自愿的腫瘤患者。5.II期臨床試驗(yàn)人體腫瘤多種多樣，目前已發(fā)現(xiàn)腫瘤大約200多種，而不同抗腫瘤藥物對不同腫瘤具有不同敏感性，在臨床上表現(xiàn)為不同的治療效果。抗腫瘤藥物II期臨床試驗(yàn)主要研究藥物對不同腫瘤的臨床治療效果和用藥方案等，確定抗腫瘤藥物在人體腫瘤治療中的應(yīng)用范圍和治療方法。國際上要求抗腫瘤藥物II期臨床試驗(yàn)在10-20個(gè)腫瘤治療中心對10-20種腫瘤患者進(jìn)行治療、觀察和研究。6.III期臨床試驗(yàn)II期臨床試驗(yàn)證明有效的抗腫瘤藥物須經(jīng)過大量人體III期臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，并對其適應(yīng)范圍進(jìn)行擴(kuò)大研究，使抗腫瘤藥物能夠發(fā)揮其最有效、最大的作用，為人類服務(wù)。國際上要求III期臨床試驗(yàn)在近百個(gè)腫瘤患者進(jìn)行治療試驗(yàn)、評價(jià)效果，建立最佳的治療方案和用藥措施。III期臨床試驗(yàn)是抗腫瘤藥物進(jìn)行商品化的最后臨床試用階段，安全、有效、規(guī)范的治療方案和用藥措施使抗腫瘤藥物商品化的基礎(chǔ)。7.商品化海洋生物資源抗腫瘤藥物研究是一個(gè)復(fù)雜、投資巨大的多學(xué)科系統(tǒng)研究，最終目的是從豐富的海洋生物資源中開發(fā)出的海洋生物抗腫瘤藥物作為特殊商品，為了保證藥物的安全、有效性和研究投資者的權(quán)益，在商品化過程中需經(jīng)有關(guān)法規(guī)、管理部門審定批準(zhǔn)，建立嚴(yán)格、統(tǒng)一的生產(chǎn)、管理規(guī)范和質(zhì)量監(jiān)測控制標(biāo)準(zhǔn)，獲取生產(chǎn)權(quán)，方可進(jìn)行生產(chǎn)，在藥品市場銷售。處于不同研究階段的海洋抗腫瘤化合物1.具有腫瘤細(xì)胞毒強(qiáng)活性化合物研究和開發(fā)海洋抗腫瘤藥物的第一步是尋找體外腫瘤細(xì)胞毒活性化合物。許多活性化合物的分離是在細(xì)胞毒性跟蹤下進(jìn)行的，并且采集樣品的初步篩選可在野外采集船上進(jìn)行。在美國NCI篩選的抗腫瘤化合物中，P388和L1210白血病腫瘤細(xì)胞對95%以上的化合物敏感，并且具有簡單、快速、靈敏等特點(diǎn)，所以在抗腫瘤活性化合物的跟蹤分離中，以上兩種腫瘤細(xì)胞應(yīng)用比較普遍，并且非常有效。目前已從海洋生物中篩選出大量具有腫瘤細(xì)胞毒活性的化合物，如:海綿Ptilocaulisspiculifer和Hemicycalesp.中的PtilomycalinA，Crambecrambe中的crambescidin816，Mycalesp.中的thiomycalolidesA和B，Hyrtioserecta中ritterrazinA;苔蘚蟲Myriaporatruncata中的myriaporone4;甲蟲Amphidiniumsp.中的amphidiniolideB;黑斑海兔Aplysiakurodai中的aplyronineA;柳珊瑚Pseudopterogorgiabipinnata中的pinnatinsA和B，IC50&10-5M等。體內(nèi)抗腫瘤活性篩選是抗腫瘤藥物臨床前研究的必要步驟，體外腫瘤細(xì)胞毒活性化合物僅有少數(shù)在體內(nèi)有效。NCI確定與對照組比較能使帶白血病腫瘤小鼠壽命延長至少25%，或能使帶實(shí)體瘤小鼠腫瘤大小減小至少60%的化合物有效。最近發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)篩選中有良好效果的化合物有:海綿Hyrtiossp.中的spongistatin1，海兔Aplysiakurodai中的aplyroninA;海洋軟體動(dòng)物Cephalodiscusgilchristi中的cephalostatin1。2.臨床前實(shí)驗(yàn)研究的海洋抗腫瘤化合物經(jīng)體內(nèi)篩選研究，療效最好的化合物將進(jìn)入臨床前實(shí)驗(yàn)研究。主要包括測試抗腫瘤化合物對不同動(dòng)物的毒性、體內(nèi)代謝、分布以及用藥途徑、劑型、劑量等對療效的影響。經(jīng)NCI推薦目前進(jìn)入該階段試驗(yàn)研究的海洋化合物:紅藻松香藻Portierahornemannii中的軟海綿素halomon;大田軟海綿HolichondrinB和海鞘Ecteinascidrinturbinada中的ecteinascidin743。其中Et743進(jìn)展較快，在體內(nèi)篩選中對B16黑色素瘤、M5076子宮瘤、LX1和Lewis肺癌、乳腺癌MX1均顯示良好的治療效果;尤其對乳腺癌MX1療效最佳，用藥23天后，10只腫瘤移植小鼠9只未見腫瘤生長，58天后有4只小鼠仍未見生長;但Et743對克隆腫瘤CXI和C38無效。進(jìn)入臨床前研究的以上化合物均顯示出對不同腫瘤細(xì)胞敏感性的差異，halomon對黑色毒瘤、P388和L1210的IC50僅為腦腫瘤、腎腫瘤和克隆腫瘤的100分之一。3.臨床I期實(shí)驗(yàn)中的海洋抗腫瘤化合物經(jīng)過近15年的系統(tǒng)跟蹤分離，1987年GeorgeR.Pettit報(bào)道了從耳狀截尾海兔Dolabellaauricularia中得到的五肽海兔毒素dolastatin10;又經(jīng)過8年的研究，該化合物被NCI推薦1995年11月進(jìn)入臨床I期實(shí)驗(yàn)。在體內(nèi)抗腫瘤篩選中，dolastatin10顯示非常好的治療效果:6.5ug/kg對P388和L1210的T/C分別為155和135;11.1ug/kg對B16黑色素瘤的T/C為238%，40%達(dá)到治愈;26ug/kg對LOX人黑色毒瘤的T/C為301%，67%治愈;13ug/kg對M5076子宮瘤為166%;40ug/kg對人子宮瘤OVCAR-3的T/C為300%。另外從同一生物中得到的膜海鞘素dolastatins11和15也列入臨床前開發(fā)抗腫瘤化合物。同時(shí)Pettit等人還對dolastatins10和15進(jìn)行了全合成、結(jié)構(gòu)修飾改造和構(gòu)效關(guān)系研究，修飾改造后得到的auristatinPE已在日本進(jìn)入臨床I期抗腫瘤研究，LU103793在歐洲即將完成臨床I期實(shí)驗(yàn)，進(jìn)入臨床II期實(shí)驗(yàn)研究。4.臨床II期實(shí)驗(yàn)中的海洋抗腫瘤化合物國際上，抗腫瘤藥物II期臨床實(shí)驗(yàn)要求在10-20個(gè)癌癥治療中心觀察抗腫瘤化合物對10-20種不同腫瘤患者的治療效果，進(jìn)入該期臨床研究的海洋抗腫瘤化合物有didemnin和bryostatin1。前景是KennethL.Rinehart在L1210細(xì)胞毒活性跟蹤下從海鞘Trididemnumsolidum中分離得到的一種環(huán)七肽，是第一個(gè)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)研究的海洋抗腫瘤化合物，1987年開始臨床II期研究。結(jié)果表明didemninB除對廢何杰金氏淋巴組織瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤有良好治療效果外，對其它腫瘤無明顯療效，并且對肝臟有較大的毒性。到目前從T.solidum和另一種短腹海鞘Aplidiumalbicans中分離出鑒定了近二十個(gè)環(huán)肽類化合物，均顯示不同程度的腫瘤細(xì)胞毒性。同時(shí)Rinehart等人對didemninB和類似物進(jìn)行了全合成、半合成、結(jié)構(gòu)修飾和構(gòu)效關(guān)系等系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)去氫didemninB的活性較didemninB強(qiáng)20倍，并且毒性較小。另外還發(fā)現(xiàn)didemnin類化合物具有對抗DNA和RNA病毒的活性和免疫抑制活性，其中didemninM的免疫抑制活性較didemninB強(qiáng)2000倍。didemnin類化合物的作用機(jī)理主要是抑制蛋白質(zhì)和DNA的合成。苔蘚蟲素Bryostatin1是1982年P(guān)ettit在P388跟蹤下叢苔蘚動(dòng)物總和草苔蟲Bugulaneritina中分離鑒定的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。到目前為止已從該生物中得到19個(gè)類似物。其中bryostatin19是我國第二軍醫(yī)大學(xué)和沈陽藥科大學(xué)姚新生等人從分布于我國海域的同種生物中發(fā)現(xiàn)的。Bryostatin類化合物均具有強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。體內(nèi)活性試驗(yàn)，bryostatin1也是一種強(qiáng)的抗腫瘤促進(jìn)劑，可抑制或激活蛋白質(zhì)代謝酶C，同時(shí)能促進(jìn)骨髓祖細(xì)胞的正常生長，1988年進(jìn)入臨床前研究，2年后進(jìn)入臨床I期人體抗腫瘤試驗(yàn)。結(jié)果表明，第一例經(jīng)bryostatin1治療的黑色素瘤患者，五年后仍健康生活;三例子宮患者，其中兩名使用合適劑量治療，三年后健康狀況良好。1995年bryostatin1開始臨床II期研究，其它抗腫瘤藥物與bryostatin1的聯(lián)合試用也在進(jìn)行。展望目前，尚無海洋抗腫瘤化合物進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)。僅有一個(gè)與海洋生物代謝產(chǎn)物相關(guān)的合成化合物阿糖胞苷并非來源于海洋生物，它是以海棉Cryptotehyacrypta分離的得到的海綿尿苷spongouridine和海棉胸苷spongothymidine為模型化合物改造合成得到的衍生物。從海綿中核苷的發(fā)現(xiàn)到阿糖胞苷開發(fā)成抗腫瘤藥物用了大約20年時(shí)間;同時(shí)從紫杉中細(xì)胞毒活性成分的發(fā)現(xiàn)到紫杉醇作為治療子宮癌藥物被FDA認(rèn)證間隔大約30年。由此可見，海洋抗腫瘤藥物的開發(fā)研究是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)間、高投入的研究，需要多學(xué)科、多方位的協(xié)作配合。進(jìn)入不同研究階段的海洋抗腫瘤化合物并不局限于某一生物門類。Crambescidin816和halichodrinB等來自海綿、ecteinascidin743和didemninB等來自海鞘、myrioporone4和bryostatin1等來自苔蘚蟲、dolastatin10和aployronineA的來自海兔、halonmon來自紅藻、pinnatinsA和B來自柳珊瑚。人們未知的任何海洋生物都可能成為抗腫瘤化合物的重要生產(chǎn)者，海洋抗腫瘤藥物的研究需要大范圍廣泛地篩選。另外，海洋抗腫瘤藥物研究中海洋抗腫瘤化合物的資源供應(yīng)是人們通常關(guān)心的重要問題。目前進(jìn)入臨床研究的化合物didemninB、bryostatin1、dolastatin10、ecteinascidin743、halonmon和halichodrinB均來源于天然海洋生物資源;大量海洋生物資源的采集會(huì)帶來許多問題。然而其他資源將來也可能成為海洋抗腫瘤藥物的重要來源。